高舒妤，朱國宴，郭國寧*

[摘 要] 目的 檢測外周血中可溶性B7-H3 在腦創傷合并骨折，單純骨折和單純腦損傷患者中的表達，并研究其對間充質干細胞分化為成骨細胞的作用。方法  ELISA檢測可溶性B7-H3 及骨折愈合的標志物Cbfa1 在腦創傷合并骨折、單純骨折，單純腦創傷和正常志愿者外周血中的表達，茜素紅、real-time   PCR 檢測不同濃度重組B7-H3 蛋白對間充質干細胞向成骨細胞分化的作用。結果 可溶性B7-H3 在腦創傷合并骨折及單純腦創傷患者中的表達明顯高于單純骨折和正常人中的表達；可溶性B7-H3 在外周血中的含量與腦創傷嚴重程度相關；重組B7-H3 蛋白可促進間充質干細胞向成骨細胞的分化，并隨著質量濃度的升高其促分化能力增強。結論 腦創傷導致的外周血中升高的可溶性B7-H3 促進了骨折愈合。

[關鍵詞] B7-H3；腦創傷合并骨折；骨折愈合；間充質干細胞

[中圖分類號] R392.7 [文獻標識碼] A

骨折愈合是一個受到全身或局部多因素調控的、包括成骨細胞和破骨細胞參與的動態平衡過程[1]，其愈合速度受多種因素的影響。臨床發現顱腦損傷骨折愈合是一個受到全身或局部多因素調控的、包括成骨細胞和破骨細胞參與的動態平衡過程[1]，其愈合速度受多種因素的影響。臨床發現顱腦損傷發展相關。對于其非免疫功能，B7-H3 敲除鼠易發生骨折，而且 B7-H3 缺失的顱骨細胞成骨分化受阻，表明B7-H3 參與了成骨細胞的分化過程，采用特異性抗體4H7 刺激人間充質干細胞膜上的B7-H3， 可直接促進其分化為成骨細胞[5-6]。

可溶性B7-H3（soluble B7-H3，sB7-H3）是膜結合型的可溶形式，可由單核細胞，樹突狀細胞，激活的T 細胞以及mB7-H3+的細胞釋放[7]，研究發現在膿毒癥患者或兒童肺炎患者中，血清中的sB7-H3 均表達升高，并與炎性因子的釋放呈正相關[8-9]。sB7-H3 與骨折愈合的研究未見報道。

間充質干細胞屬于成體干細胞，在不同誘導條件下，具有向成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞等多種細胞分化的潛能，并且由于具來源廣泛、細胞增殖快、異體移植排斥反應輕等優點，在骨組織工程中備受重視，是形成成骨細胞的主要來源。

為研究sB7-H3 在腦創傷合并骨折愈合中的作用，我們對臨床腦創傷合并骨折與單純骨折患者及單純腦創傷患者sB7-H3 表達與骨折愈合的關系進行了探討，研究了體外加入重組B7-H3 蛋白對間充質干細胞分化為成骨細胞的作用。

1資料與方法

1.1臨床資料 選取自 2014 年 2 月至 2016 年 11 月入住重慶西南醫院急救部的患者共56 例（男36 例， 女20 例），分別納入單獨腦創傷組（TBI）13 例，單獨骨折組（Fracture）20 例，腦創傷合并骨折組（TBI +fracture）23 例，骨折部位包括：股骨（femur）骨折14 例， 脛腓骨（tibia and fibula）骨折 11 例，肱骨（humerus） 骨折 10 例，尺撓骨（ulna and radius）骨折 8 例，另選擇健康體檢志愿者10 例為對照組。入院時有腦創傷的患者按GCS 評分分級：GCS>12 為輕度（Mild）腦創傷（6 例），9≤GCS≤12 為中度（Moderate）（9 例），3≤GCS≤8 為重度（Severe）（8 例），所有病例均排除傷前神經病理或與骨相關的疾病，類風濕性關節炎、糖尿病及采用類固醇或雙膦酸治療的疾病。本研究經lu軍軍醫大學（第三軍醫大學）附屬醫院倫理委員會批準并獲得患者知情同意書。

1.2血清樣本的收集 所有患者均于入院后12 h 內采血，正常志愿者清晨空腹采集外周靜脈血 3 ml，4 ℃冰箱放置過夜，3 500 g 離心10 min，吸出上層血清置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.3ELISA 檢測 人 B7-H3 ELISA 試劑盒購自Ebioscience 公司，人Cbfa1 ELISA 試劑盒購自上海滬鼎生物科技有限公司。實驗操作按說明書進行。

1.4間充質干細胞培養及誘導分化 培養人間充質干細胞至第3 代，更換間充質干細胞培養基為成骨細胞誘導培養基（賽業生物），并分別加入2 μg/ml 和5 μg/ml 的重組B7-H3 蛋白（R&D 公司），培養 14 d 后，茜素紅S 染色檢測成骨細胞礦化，在顯微鏡下任意選擇 5 個視野，進行細胞數統計；收獲細胞， real-time PCR檢測Cbfa1 的表達。

1.5RNA 提取和real-time PCR檢測 Trizol 法提取RNA，測定濃度及純度。人源 Cbfa1 基因的定量表達檢測基于 L40992 序列進行引物設 計（Primer Primie 5.0 軟件輔助），隨后BLAST 確認引物特異性， 預期產物長度132 bp，用GAPDH 作內參，預期產物長度 197 bp，交由上海生工生物工程有限公司合成。取1 μg 總RNA，按照TOYOBO 逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，進行 SYBR 摻入法半定量檢測Cbfa1 的相對表達量（2-△△CT 法），反應條件: 95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，40 個循環，完成PCR 擴增。引物序列如下：Cbfa1 F:5′-CCGCCTC AGTGATTTAGGGC-3′，R：5′-GGGTCTGTAATCTGA CTCTGTCC-3′；GAPDH F：5′-GGAGCGAGATCCCTC CAAAAT-3′ ，R ：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATG

G-3′。

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